NY_T 2289-2012 小麦矮腥黑穗病菌检疫检测与鉴定方法
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文件大小(MB)： |
0.7 |
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11 |
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日期： |
2024-8-13 |
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ics 65.020,B 16 NY,中华人民共和国农业行业标准,NY/T 2289—2012,小麦矮腥黑穗病菌检疫检测与鉴定方法,Detection and identification of Tilletia controversa Kiihn,2012-12-24 发布 2013-03-01 实施,中华人民共和国农业部 发布,NY/T 2289—2012,刖 s,本标准按照GB/T 1.!给出的规则起草,本标准由农业部种植业管理司提出,本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC 271)归ロ,本标准起草单位:全国农业技术推广服务中心、四川省植物检疫站、重庆大学,本标准主要起草人:王福祥、刘可、王中康、宁红、熊红利、殷幼平、刘慧、李潇楠、万佳,I,NY/T 2289—2012,小麦矮腥黑穗病菌检疫检测与鉴定方法,1范围,本标准规定了农业植物检疫中小麦矮腥黑穗病菌（T辺田a controversa Kiihn,TCK）样品采集、样,品处理、实验室形态学、实时荧光PCR检验及结果判定和除害处理的技术方法,本标准适用于小麦种子、籽粒及产品、生长期植株小麦矮腥黑穗病菌的检疫检测和鉴定,2规范性引用文件,下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文,件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件,GB 7412小麦种子产地检疫规程,GB 15569农业植物调运检疫规程,GB/T 18085植物检疫小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法,3术语和定义,下列术语和定义适用于本文件,3. 1,小麦矮腹黑穗病 Dwarf bunt disease,由小麦矮腥黑穗病菌controversa Kiihn,TCK）引起的麦类真菌病害,特征表现为罹病植,株矮化,病穗麦粒变为病原菌冬胞子构成的菌農,不能食用,导致严重的产量损失并影响小麦加工产品,品质,3.2,网脊高度值Reticulum height,指腥黑穗病菌冬胞子外胞壁向外突起的垂直高度值,在光学显微镜下表现为冬花子外胞壁的刺状,或齿状突起的垂直高度,3.3,实时荧光定量 PCRQPCR,也叫实时荧光聚合醵链式反应。是ー种能在体外微量扩增的特殊DNA片段,在扩增过程中由于,荧光物质的释放而实时快速、灵敏地检出模板DNA存在的方法,3.4,Q - PCR 阈值 Threshold of Q - PCR,PCR反应实时荧光强度超过背景荧光强度的值或检测值,3.5,Q - PCR Ct 值 Cycle threshold value of Q- PCR,实时荧光PCR反应检测样品的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数,3.6,典型的扩增曲线 Typical amplification curve,一个典型的扩增曲线由三个阶段组成:荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。指数,扩增阶段PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系,1,ny/t 2289—2012,3.7,荧光染料 SYBR Green I,非特异性结合双链DNA的ー种荧光染料,其荧光信号随着dsDNA扩增产物的增加而增强,4原理,小麦矮腥黑穗病菌（T，〃女ia co"疗cwersa Kiihn, TCK）,属担子菌门Basidiomycota,冬胞菌纲Teliomycetes,黑粉菌目Ustilaginales,腥黑粉菌科Tilletiaceae,腥黑粉菌属Tilletia0病菌主要对小麦、大,麦、黑麦等禾本科18属的农作物和杂草形成系统侵染,被侵染作物结实时形成菌慶。病菌以冬抱子附,着在种子外表或混入粪肥、土壤中越夏,随着受害种子、土壤和肥料的远距离运输而传播;也可以菌慶形,式混杂于种子中,远距离传播。小麦矮腥黑穗病菌的冬胞子形态、Q- PCR反应结果是本标准快速鉴定,该病原菌的依据,4. !冬抱子形态,小麦矮腥黑穗病菌冬抱子呈球形、椭圆形或不规则形,具网状饰纹和无色到淡色的胶质鞘,直径（含,胶质鞘）为16. 80 mm.32. 19 /Lim,通常为18 /xm.24 〃m。冬抱子网脊高度值是小麦矮腥黑穗病菌和其,近似种小麦网腥黑穗病菌（Tz〃凶Zeaかes Tul. , TCT）冬抱子最重要的区别特征,前者的网脊高度值为,1. 43伊m士。. 14 pim,后者为0. 53 土。. 19 Mmo冬抱子自发荧光和萌发生理试验也可以作为进ー步鉴,定的依据,4. 2 Q-PCR,本标准采用Q- PCR荧光染料法进行检测。利用病菌特有DNA序列设计引物,在PCR扩增时加,入荧光染料,荧光染料结合dsDNA扩增产物而发出荧光,由荧光检测器实时检测。由于初始模板量的,不同,反应管内的荧光物质达到设定的可检测阈值时所经历的Ct值不同,因此在模板定量的情况下,Ct,值可以用于判定检测样品的初始菌量,实现定量?CR检测,5试剂与材料,除特别说明以外,本标准所用样品制备试剂均为分析纯,5. !冬抱子形态检验试剂,吐温ー20（Tツ6611-20）、乙酸钾《!<3。r）。ゆ、甘油93国〇3）、乙醇92旦〇即、柠檬酸（じ6用07）、,蒸储水（旦0）、磷酸氢二钠（Na2HPO4）o,5.2 Q-PCR检验试剂,淀粉酶（Amylase）、液氮（Nハ、磷酸盐缓冲液、冬徇子裂解液、DNA释放剂、DNA提取液、TE缓冲,液、DNA洗涤液、SYBR Q-PCR反应混合液等,Q-PCR检验试剂配制方法参见附录A,6仪器及用具,6.1 冬抱子形态检验仪器及用具,显微镜、测微尺、低速离心机、高压灭菌器、天平和可调微量加样器,6.2 Q-PCR检……
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